Ташаккур ба шумо барои боздид аз Nature.com.Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад.Барои таҷрибаи беҳтарин, мо тавсия медиҳем, ки шумо браузери навшударо истифода баред (ё Ҳолати мутобиқатро дар Internet Explorer хомӯш кунед).Дар ҳамин ҳол, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубҳо ва JavaScript пешкаш хоҳем кард.
Векторҳои генӣ барои муолиҷаи фибрози кистикии шуш бояд ба роҳҳои интиқолдиҳандаи ҳаво нигаронида шаванд, зеро интиқоли шушҳои перифералӣ таъсири табобатӣ надорад.Самаранокии интиқоли вирус мустақиман ба вақти истиқомати интиқолдиҳанда вобаста аст.Бо вуҷуди ин, моеъҳои интиқолдиҳанда, ба монанди интиқолдиҳандагони ген, ҳангоми нафаскашӣ табиатан ба алвеолаҳо паҳн мешаванд ва зарраҳои терапевтии ҳама гуна шакл тавассути интиқоли мукосилиарӣ зуд хориҷ карда мешаванд.Дароз кардани мӯҳлати будубоши интиқолдиҳандагони ген дар роҳи нафас муҳим аст, аммо ноил шудан душвор аст.Заррачаҳои магнитии бо интиқолдиҳанда пайвастшуда, ки метавонанд ба сатҳи роҳи нафас равона карда шаванд, ҳадафҳои минтақавиро беҳтар мекунанд.Аз сабаби мушкилот бо тасвири in vivo, рафтори чунин зарраҳои магнитии хурд дар сатҳи роҳи нафас дар ҳузури майдони магнитии татбиқшаванда суст фаҳмида мешавад.Мақсади ин тадқиқот истифодаи тасвири синхротронӣ барои визуализатсияи ҳаракати як қатор зарраҳои магнитӣ дар трахеяи каламушҳои наркозшуда бо мақсади омӯзиши динамика ва шакли рафтори зарраҳои яклухт ва калон дар vivo буд.Сипас, мо инчунин арзёбӣ кардем, ки оё интиқоли зарраҳои магнитии лентивирусӣ дар ҳузури майдони магнитӣ самаранокии интиқолро дар трахеяи каламуш зиёд мекунад.Тасвири рентгении синхротрон рафтори заррачаҳои магнитиро дар майдонҳои магнитии статсионарӣ ва ҳаракаткунанда дар vitro ва in vivo нишон медиҳад.Зарраҳоро тавассути магнитҳо дар рӯи роҳҳои зинда ба осонӣ кашидан мумкин нест, аммо ҳангоми интиқол пасандозҳо дар майдони назар ҷамъ мешаванд, ки майдони магнитӣ дар он ҷо пурқувваттар аст.Ҳангоми интиқоли зарраҳои магнитии лентивирусӣ дар ҳузури майдони магнитӣ самаранокии интиқол низ шаш маротиба афзоиш ёфт.Якҷоя, ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки зарраҳои магнитии лентивирусӣ ва майдонҳои магнитӣ метавонанд равишҳои арзишманд барои беҳтар кардани ҳадафи вектори генҳо ва сатҳи интиқол дар роҳҳои ҳавоии интиқолдиҳанда дар vivo бошанд.
Фибрози кистикӣ (CF) дар натиҷаи тағирот дар як ген бо номи танзимгари интиқоли трансмембрании CF (CFTR) ба вуҷуд меояд.Протеини CFTR як канали ионист, ки дар бисёр ҳуҷайраҳои эпителиалӣ дар тамоми бадан мавҷуд аст, аз ҷумла роҳҳои нафас, макони асосии патогенези фибрози кистикӣ.Норасоиҳо дар CFTR ба интиқоли ғайримуқаррарии об, хушкшавии сатҳи роҳи нафас ва кам шудани умқи қабати сатҳи моеъи роҳи нафас (ASL) оварда мерасонад.Он инчунин қобилияти системаи интиқоли мукосилиариро (MCT) барои тоза кардани роҳҳои нафас аз зарраҳои нафаскашӣ ва микроорганизмҳо халалдор мекунад.Ҳадафи мо таҳияи як терапияи лентивирусӣ (LV) барои расонидани нусхаи дурусти гени CFTR ва беҳтар кардани саломатии ASL, MCT ва шуш ва идома додани таҳияи технологияҳои нав, ки ин параметрҳоро дар vivo1 чен карда метавонанд.
Векторҳои LV яке аз номзадҳои пешбари табобати гении фибрози кистикӣ мебошанд, асосан аз он сабаб, ки онҳо метавонанд гени терапевтиро ба ҳуҷайраҳои базалии роҳи нафас (ҳуҷайраҳои бунёдии роҳи нафас) ба таври доимӣ муттаҳид кунанд.Ин муҳим аст, зеро онҳо метавонанд тавассути тафовут ба ҳуҷайраҳои функсионалии гени ислоҳшудаи роҳи нафас, ки бо фибрози кистикӣ алоқаманданд, метавонанд гидратсияи муқаррарӣ ва тозакунии луобро барқарор кунанд, ки дар натиҷа манфиатҳои умрбод ба даст меоранд.Векторҳои LV бояд ба муқобили роҳҳои гузаранда равона карда шаванд, зеро дар ин ҷо ҷалби шуш дар CF оғоз меёбад.Интиқоли вектор ба шуш амиқтар метавонад боиси интиқоли алвеолярӣ гардад, аммо ин дар фибрози кистикӣ таъсири табобатӣ надорад.Бо вуҷуди ин, моеъҳо ба монанди интиқолдиҳандагони ген табиатан ҳангоми нафаскашӣ пас аз таваллуд ба алвеолаҳо муҳоҷират мекунанд3,4 ва зарраҳои табобатӣ тавассути MCTs зуд ба холигоҳи даҳон хориҷ карда мешаванд.Самаранокии интиқоли LV мустақиман ба дарозии вақти дар наздикии ҳуҷайраҳои мавриди ҳадаф мондани вектор вобаста аст, то ки ба гирифтани ҳуҷайра имкон диҳад - "вақти истиқомат" 5, ки тавассути ҷараёни ҳавоии маъмулии минтақавӣ ва инчунин қабули ҳамоҳангшудаи луоб ва зарраҳои MCT ба осонӣ кӯтоҳ карда мешавад.Барои фибрози кистикӣ, қобилияти дароз кардани вақти истиқомати LV дар роҳҳои нафас барои ноил шудан ба сатҳи баланди интиқол дар ин минтақа муҳим аст, аммо то ҳол мушкил буд.
Барои бартараф кардани ин монеа, мо пешниҳод менамоем, ки зарраҳои магнитии LV (MP) метавонанд дар ду роҳи иловагӣ кӯмак кунанд.Аввалан, онҳо метавонанд тавассути магнит ба сатҳи роҳи нафас роҳнамоӣ карда шаванд, то ҳадафро беҳтар кунанд ва ба зарраҳои интиқолдиҳандаи ген кӯмак кунанд, ки дар минтақаи дурусти роҳи нафас ҷойгир шаванд;ва ASL) ба қабати ҳуҷайра мегузаранд 6. Депутатҳо ба таври васеъ ҳамчун воситаи интиқоли маводи мухаддир ба таври васеъ истифода мешаванд, вақте ки онҳо ба антителоҳо, доруҳои химиотерапия ё дигар молекулаҳои хурде, ки ба мембранаҳои ҳуҷайра пайваст мешаванд ё ба ретсепторҳои сатҳи ҳуҷайраи онҳо мепайванданд ва дар ҷойҳои варам ҷамъ мешаванд. мавҷудияти нерӯи статикӣ.Майдонҳои магнитӣ барои табобати саратон 7. Дигар усулҳои "гипертермикӣ" ба куштани ҳуҷайраҳои варам тавассути гарм кардани МП ҳангоми дучор шудан ба майдонҳои магнитии ларзиш нигаронида шудаанд.Принсипи трансфексияи магнитӣ, ки дар он майдони магнитӣ ҳамчун агенти трансфексия барои баланд бардоштани интиқоли ДНК ба ҳуҷайраҳо истифода мешавад, одатан дар vitro бо истифода аз як қатор векторҳои генҳои вирусӣ ва вирусӣ барои хатҳои интиқоли ҳуҷайраҳои душвор истифода мешавад. ..Самаранокии магнитотрансфекцияи LV бо интиқоли LV MP in vitro ба хати ҳуҷайраи эпителияи бронхи инсон дар ҳузури майдони магнитии статикӣ муқаррар карда шуд, ки самаранокии интиқолро нисбат ба танҳо вектори LV 186 маротиба зиёд кард.LV MT инчунин ба модели in vitro фибрози кистикӣ татбиқ карда шудааст, ки дар он трансфексияи магнитӣ интиқоли LV-ро дар фарҳангҳои интерфейси ҳаво бо моеъ то 20 маротиба дар ҳузури балғами фибрози кистикӣ зиёд кардааст10.Бо вуҷуди ин, магнитотрансфекцияи узвҳо дар vivo нисбатан кам таваҷҷӯҳ зоҳир карда шудааст ва танҳо дар якчанд таҳқиқоти ҳайвонот арзёбӣ шудааст11,12,13,14,15, махсусан дар шушҳо16,17.Бо вуҷуди ин, имкониятҳои интиқоли магнитӣ дар табобати шуш дар фибрози кистикӣ равшананд.Тан ва дигарон.(2020) изҳор дошт, ки "таҳқиқоти тасдиқкунӣ оид ба интиқоли самараноки шушҳои нанозарраҳои магнитӣ роҳро барои стратегияҳои ояндаи нафаскашии CFTR барои беҳтар кардани натиҷаҳои клиникӣ дар беморони гирифтори фибрози кистикӣ боз мекунад"6.
Рафтори заррачахои хурди магнитиро дар сатхи рохи нафас хангоми мавчУД будани майдони магнитии татбикшаванда тасаввур кардан ва омухтан душвор аст ва бинобар ин онхо суст фахмида мешаванд.Дар таҳқиқоти дигар, мо як усули синхротрон дар асоси марҳилаи тасвири контрасти рентгенӣ (PB-PCXI) барои тасвири ғайриинвазивӣ ва миқдорӣ тағироти дақиқаи дар vivo дар умқи ASL18 ва рафтори MCT1920 барои чен кардани бевоситаи гидратсияи сатҳи канали газ таҳия кардем. ва ҳамчун нишондиҳандаи барвақти самаранокии табобат истифода мешавад.Илова бар ин, усули баҳодиҳии MCT-и мо зарраҳои диаметри 10-35 мкм-ро истифода мебарад, ки аз гилхок ё шишаи шохиси рефраксияи баланд иборатанд, ҳамчун аломатҳои MCT, ки бо PB-PCXI21 намоёнанд.Ҳарду усул барои тасвири як қатор намудҳои зарраҳо, аз ҷумла МП мувофиқанд.
Аз сабаби ҳалли баланди фазоӣ ва муваққатӣ, таҳлилҳои ASL ва MCT дар асоси PB-PCXI мо барои омӯзиши динамика ва намунаҳои рафтори зарраҳои ягона ва оммавӣ дар vivo хуб мувофиқанд, то ба мо дар фаҳмидан ва оптимизатсияи усулҳои интиқоли генҳои МП кӯмак расонанд.Равише, ки мо дар ин ҷо истифода мебарем, ба таҳқиқоти мо бо истифода аз хати нури SPring-8 BL20B2 асос ёфтааст, ки дар он мо ҳаракати моеъро пас аз интиқоли як вояи вектори думҳо ба роҳҳои бинӣ ва шуши мушҳо визуалӣ кардем, то дар шарҳи шакли экспрессияи генҳои гетерогении мо мушоҳида карда шавад. дар гени мо.омӯзиши ҳайвонот бо вояи интиқолдиҳандаи 3,4.
Ҳадафи ин тадқиқот истифодаи синхротрони PB-PCXI барои визуализатсияи ҳаракатҳои як қатор депутатҳо дар трахеяи каламушҳои зинда буд.Ин таҳқиқоти тасвирии PB-PCXI барои санҷидани силсилаи MP, қувваи майдони магнитӣ ва ҷойгиршавӣ барои муайян кардани таъсири онҳо ба ҳаракати MP тарҳрезӣ шудааст.Мо тахмин мезадем, ки майдони магнитии беруна ба MF-и расонидашуда дар мондан ё ба минтақаи мавриди ҳадаф ҳаракат кардан кӯмак мекунад.Ин тадқиқотҳо инчунин ба мо имкон доданд, ки конфигуратсияҳои магнитиро муайян кунем, ки миқдори зарраҳои пас аз таҳшиншавӣ дар трахея боқӣ мондаро ба ҳадди аксар расонанд.Дар як силсилаи дуюми таҳқиқот, мо ҳадафи он будем, ки ин конфигуратсияи оптималиро барои нишон додани шакли интиқол, ки дар натиҷаи интиқоли LV-MP ба роҳҳои ҳавоии каламушҳо бармеояд, бо назардошти он, ки интиқоли LV-MPs дар заминаи ҳадафгирии роҳи ҳавоӣ натиҷа медиҳад дар баланд бардоштани самаранокии интиқоли LV..
Ҳама таҳқиқоти ҳайвонот мувофиқи протоколҳои тасдиқшудаи Донишгоҳи Аделаида (M-2019-060 ва M-2020-022) ва Кумитаи этикаи ҳайвоноти SPring-8 Synchrotron гузаронида шуданд.Таҷрибаҳо мувофиқи тавсияҳои ARRIVE гузаронида шуданд.
Ҳама тасвирҳои рентгенӣ дар хати нури BL20XU дар синхротрони SPring-8 дар Ҷопон бо истифода аз насбе, ки қаблан тавсиф шуда буд, гирифта шудаанд21,22.Хулоса, қуттии таҷрибавӣ 245 м аз ҳалқаи нигаҳдории синхротрон ҷойгир шудааст.Масофаи байни намуна то детектор 0,6 м барои омӯзиши тасвири зарраҳо ва 0,3 м барои омӯзиши тасвири in vivo барои эҷоди эффектҳои контрасти марҳилавӣ истифода мешавад.Шуои монохроматии энергияи 25 кеВ истифода шуд.Тасвирҳо бо истифода аз табдилдиҳандаи рентгении баландсифат (SPring-8 BM3), ки бо детектори sCMOS пайваст карда шудаанд, гирифта шудаанд.Табдилдиҳанда нурҳои рентгениро ба нури намоён бо истифода аз сцинтиляттори ғафси 10 мкм (Gd3Al2Ga3O12) табдил медиҳад, ки баъдан бо истифода аз объекти микроскопи ×10 (NA 0,3) ба сенсори sCMOS равона карда мешавад.Детектори sCMOS як Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Ҷопон) бо андозаи массиви 2048 × 2048 пиксел ва андозаи хоми пиксел 6,5 × 6,5 микрон буд.Ин танзим андозаи изотропии пикселии самарабахши 0,51 микрон ва майдони назари тақрибан 1,1 мм × 1,1 мм медиҳад.Давомнокии 100 мс барои баланд бардоштани таносуби сигнал ба садои зарраҳои магнитӣ дар дохили ва берун аз роҳҳои нафас ва кам кардани артефактҳои ҳаракат дар натиҷаи нафаскашӣ интихоб карда шуд.Барои таҳқиқоти in vivo, пардаи рентгении зуд дар роҳи рентгенӣ ҷойгир карда шуд, то вояи радиатсионӣ тавассути бастани чӯби рентгенӣ байни экспозицияҳо маҳдуд карда шавад.
ВАОи LV дар ягон таҳқиқоти тасвирии SPring-8 PB-PCXI истифода нашудааст, зеро камераи тасвирии BL20XU дараҷаи биологии 2 сертификат надорад.Ба ҷои ин, мо як қатор депутатҳои хуб тавсифшударо аз ду фурӯшандаи тиҷоратӣ интихоб кардем, ки як қатор ҳаҷмҳо, маводҳо, консентратсияи оҳан ва барномаҳоро дар бар мегиранд - аввал барои фаҳмидани он ки чӣ гуна майдонҳои магнитӣ ба ҳаракати МП дар капиллярҳои шишагӣ таъсир мерасонанд ва сипас дар роҳҳои зинда.сатҳи.Андозаи МП аз 0,25 то 18 мкм фарқ мекунад ва аз маводи гуногун сохта шудааст (ниг. ба ҷадвали 1), аммо таркиби ҳар як намуна, аз ҷумла андозаи зарраҳои магнитӣ дар МП маълум нест.Бар асоси таҳқиқоти густурдаи MCT 19, 20, 21, 23, 24, мо интизорем, ки депутатҳои то 5 мкм дар сатҳи роҳи нафасии трахея дидан мумкин аст, масалан, тавассути тарҳ кардани чаҳорчӯбаҳои пайдарпай барои дидани визуалии беҳтари ҳаракати МП.Як МП 0,25 мкм аз қарори дастгоҳи тасвирӣ хурдтар аст, аммо интизор меравад, ки PB-PCXI контрасти ҳаҷмӣ ва ҳаракати моеъи рӯизаминиро, ки пас аз гузоштан дар он ҷойгир шудаанд, муайян кунад.
Намунаҳо барои ҳар як депутат дар ҷадвал.1 дар капиллярҳои шишагии 20 мкл (Drummond Microcaps, PA, ИМА) бо диаметри дохилии 0,63 мм омода карда шудааст.Зарраҳои корпускулӣ дар об мавҷуданд, дар ҳоле ки зарраҳои CombiMag дар моеъи хусусии истеҳсолкунанда мавҷуданд.Ҳар як найча нисфи бо моеъ пур карда мешавад (тақрибан 11 мкл) ва ба дорандаи намуна гузошта мешавад (ниг. Расми 1).Капиллярҳои шишагин ба таври уфуқӣ дар саҳна дар камераи тасвирӣ ҷойгир карда шуданд ва дар кунҷҳои моеъ ҷойгир карда шуданд.Диаметри 19 мм (дарозии 28 мм) магнити никелли аз хоки нодир, неодим, оҳан ва бор (NdFeB) сохташуда (N35, кат. № LM1652, Jaycar Electronics, Австралия) бо нигоҳдории 1,17 Т ҷадвали интиқоли ҷудогона барои ноил шудан ба фосилаи дур мавқеи худро дар давоми намоиши тағйир.Тасвири рентгенӣ вақте оғоз мешавад, ки магнит тақрибан 30 мм дар болои намуна ҷойгир карда мешавад ва тасвирҳо дар 4 кадр дар як сония ба даст меоянд.Ҳангоми тасвир кардан магнитро ба найчаи капиллярии шишагӣ (дар масофаи тақрибан 1 мм) наздик карданд ва сипас барои баҳодиҳии таъсири қувваи майдон ва мавқеъ дар қад-қади найча ҳаракат карданд.
Насби тасвири in vitro, ки дорои намунаҳои MP дар капиллярҳои шишагӣ дар марҳилаи тарҷумаи намунаи xy мебошад.Рохи шуои рентгенй бо хати сурхи нухта нишон дода шудааст.
Пас аз он, ки дар in vitro дидани вакилони парлумон муқаррар карда шуд, як қисми онҳо дар каламушҳои ваҳшӣ-албинои Wistar (~12 ҳафтаина, ~ 200 г) озмоиш карда шуданд.Медетомидин 0,24 мг/кг (Домитор®, Зеноак, Ҷопон), мидазолам 3,2 мг/кг (Дормикум®, Астеллас Фарма, Ҷопон) ва буторфанол 4 мг/кг (Веторфале®, Мэйдзи Сейка).Каламушҳо бо омехтаи Pharma (Ҷопон) тавассути тазриқи дохили перитоналӣ наркоз карда шуданд.Пас аз анестезия, онҳо тавассути гирифтани курку дар атрофи трахея, гузоштани найчаи эндотрахеалӣ (ET; 16 Ga cannula intravenous, Terumo BCT) ва дар ҳолати супинӣ дар пластинкаи тасвирии фармоишӣ, ки дорои халтаи гармӣ мебошад, барои тасвир омода карда шуданд. барои нигоҳ доштани ҳарорати бадан.22. Пас аз он, лавҳаи тасвирӣ ба марҳилаи намуна дар қуттии тасвирӣ бо кунҷи каме часпонида шуд, то трахеяро ​​ба таври уфуқӣ дар тасвири рентгенӣ мувофиқ созад, тавре ки дар расми 2а нишон дода шудааст.
(a) Танзими тасвири in vivo дар воҳиди тасвирии SPring-8, роҳи рентген бо хати нуқтаи сурх нишон дода шудааст.(б, в) Ҷойгиркунии магнити трахея ба таври фосилавӣ бо истифода аз ду камераи IP-и ортогоналӣ насб карда шуд.Дар тарафи чапи тасвир дар экран, шумо метавонед ҳалқаи симро, ки сарро нигоҳ медорад ва канулаи интиқол дар дохили найчаи ET насбшударо мебинед.
Системаи насоси сӯзандоруҳои дурдаст идорашаванда (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) бо истифода аз сӯзандоруи шишагии 100 мкл ба қубури PE10 (0,61 мм OD, 0,28 мм ID) бо сӯзани 30 Ga пайваст карда шуд.Тубаро қайд кунед, то боварӣ ҳосил кунед, ки нӯг дар ҳолати дуруст дар трахея ҳангоми ворид кардани найчаи эндотрахеалӣ аст.Бо истифода аз микронасос, поршени сӯзандору хориҷ карда шуд ва нӯги найча ба намунаи МП, ки бояд интиқол дода шавад, таъмид карда шуд.Пас аз он найчаи интиқоли боршуда ба найчаи эндотрахеалӣ гузошта шуд ва нӯги онро дар қавитарин қисми майдони магнитии истифодашавандаи мо ҷойгир кард.Гирифтани тасвир бо истифода аз детектори нафаскашӣ, ки ба қуттии вақтбандии мо дар асоси Arduino пайваст карда шудааст, назорат карда шуд ва ҳама сигналҳо (масалан, ҳарорат, нафаскашӣ, кушода/пушидани парда ва гирифтани тасвир) бо истифода аз Powerlab ва LabChart (AD Instruments, Сидней, Австралия) сабт карда шуданд. 22 Ҳангоми тасвиркунӣ Вақте ки манзил дастрас набуд, ду камераи IP (Panasonic BB-SC382) тақрибан дар 90° ба ҳамдигар ҷойгир карда шуданд ва барои назорат кардани мавқеи магнит нисбат ба трахея ҳангоми тасвир истифода мешуданд (Расми 2b, в).Барои кам кардани артефактҳои ҳаракат, як тасвир дар як нафас ҳангоми платои ҷараёни нафаскашии терминал ба даст оварда шуд.
Магнит ба марҳилаи дуюм пайваст карда шудааст, ки он метавонад дар беруни бадани тасвирӣ ҷойгир карда шавад.Мавқеъҳо ва конфигуратсияҳои гуногуни магнит санҷида шуданд, аз ҷумла: дар кунҷи тақрибан 30° болотар аз трахея ҷойгир карда шудаанд (конфигуратсияҳо дар расмҳои 2а ва 3а нишон дода шудаанд);як магнит дар болои хайвон ва дигаре дар поён, бо сутунхои барои чалби гузошташуда (расми 3б)., як магнит дар болои ҳайвон ва як магнит дар поён, бо қутбҳо барои бозсозӣ (расми 3в) ва як магнит дар боло ва перпендикуляр ба трахея (расми 3d).Пас аз насб кардани ҳайвон ва магнит ва бор кардани МП таҳти озмоиш ба насоси сӯзандору, пас аз гирифтани тасвирҳо вояи 50 мкл бо суръати 4 мкл/сек интиқол диҳед.Пас аз он магнит дар баробари трахея ба пеш ва пеш ҳаракат мекунад ва ҳангоми гирифтани тасвирҳо идома медиҳад.
Конфигуратсияи магнитӣ барои тасвири in vivo (a) як магнит дар болои трахея бо кунҷи тақрибан 30°, (б) ду магнит барои ҷалб танзим карда шудааст, (в) ду магнит барои бозсозӣ танзим карда шудааст, (г) як магнит дар боло ва перпендикуляр ба трахея.Нозир ба воситаи трахея аз даҳон ба шуш ба поён нигарист ва нури рентгенӣ аз тарафи чапи каламуш гузашта, аз тарафи рост баромад.Магнит ё дар дарозии роҳи нафас ё ба тарафи чап ва рост аз трахея ба самти шуои рентгенӣ ҳаракат мекунад.
Мо инчунин кӯшиш кардем, ки аёният ва рафтори зарраҳоро дар роҳҳои нафас ҳангоми омехта набудани нафаскашӣ ва суръати дил муайян кунем.Аз ин рӯ, дар охири давраи тасвир, ҳайвонот аз сабаби аз меъёр зиёди пентобарбитал (Сомнопентил, Питман-Мур, Вашингтон Кроссинг, ИМА; ~65 мг / кг ip) ба таври инсонӣ эвтаниз карда шуданд.Баъзе ҳайвонҳо дар платформаи тасвирӣ монданд ва пас аз қатъ шудани нафаскашӣ ва тапиши дил, раванди тасвиркунӣ такрор карда шуд, агар дар сатҳи роҳи нафас ягон МП намоён набошад, миқдори иловагии МП илова карда шуд.
Тасвирҳои натиҷавӣ барои майдони ҳамвор ва торик ислоҳ карда шуданд ва сипас бо истифода аз скрипти фармоишии дар MATLAB (R2020a, The Mathworks) навишташуда ба филм (20 кадр дар як сония; 15–25 × суръати муқаррарӣ вобаста ба суръати нафас) ҷамъ карда шуданд.
Ҳама тадқиқотҳо оид ба интиқоли вектори генҳои LV дар Маркази тадқиқоти ҳайвоноти лаборатории Донишгоҳи Аделаида гузаронида шуда буданд ва ҳадафи он истифодаи натиҷаҳои таҷрибаи SPring-8 барои муайян кардани он, ки оё интиқоли LV-MP дар ҳузури майдони магнитӣ интиқоли генҳоро дар vivo афзоиш дода метавонад. .Барои баҳо додан ба таъсири МФ ва майдони магнитӣ, ду гурӯҳи ҳайвонот табобат карда шуданд: ба як гурӯҳ LV MF бо ҷойгиркунии магнитӣ ва ба гурӯҳи дигар бо гурӯҳи назоратӣ бо LV MF бе магнит сӯзандору гузаронида шуд.
Векторҳои генҳои LV бо истифода аз усулҳои қаблан тавсифшуда 25, 26 тавлид шудаанд.Вектори LacZ як гени локализатсияи ядроии бета-галактозидазаро ифода мекунад, ки аз ҷониби промотори конститутсионии MPSV (LV-LacZ) идора карда мешавад, ки дар ҳуҷайраҳои трансдуксионӣ маҳсулоти реаксияи кабудро ба вуҷуд меорад, ки дар фронтҳо ва қисмҳои бофтаи шуш намоён аст.Титратсия дар фарҳангҳои ҳуҷайра тавассути ҳисоб кардани шумораи ҳуҷайраҳои LacZ-мусбат бо истифода аз гемоцитометр барои ҳисоб кардани титр дар TU/ml анҷом дода шуд.Интиқолдиҳандаҳо дар -80 ° C дар криоконсерватсия карда мешаванд, пеш аз истифода об карда мешаванд ва ба CombiMag бо омехтаи 1: 1 ва дар яхдон на камтар аз 30 дақиқа пеш аз таҳвил баста мешаванд.
Каламушҳои муқаррарии Sprague Dawley (n = 3/гурӯҳ, ~ 2-3 анестезияи IP бо омехтаи 0,4 мг/кг медетомидин (Домитор, Илиум, Австралия) ва 60 мг / кг кетамин (Илиум, Австралия) дар синни 1 моҳа) ip ) тазриќї ва ѓайриљарроњї канюля шифоњї бо 16 Ga ба дохили вена.Барои таъмини он, ки бофтаи роҳи нафаси трахея интиқоли LV-ро мегирад, он бо истифода аз протоколи вайроншавии механикии қаблан тавсифшуда шарт карда шуд, ки дар он сатҳи роҳи нафас бо сабади сим ба таври аксӣ молида шуд (N-Circle, истихроҷи санги нитинол бе нӯги NTSE-022115 ) -UDH , Кук тиббй, ШМА) 30 с28.Сипас, тақрибан 10 дақиқа пас аз халалдоршавӣ дар кабинети биологӣ, маъмурияти трахеалии LV-MP анҷом дода шуд.
Майдони магнитие, ки дар ин таҷриба истифода шудааст, шабеҳи омӯзиши рентгении in vivo бо ҳамон магнитҳо дар болои трахея бо тазиқи стенти дистилятсия нигоҳ дошта шуда буд (Расми 4).Ҳаҷми 50 мкл (2 x 25 мкл аликвот) LV-MP ба трахея (n = 3 ҳайвон) бо истифода аз пипеткаи гелдор, ки қаблан тавсиф шуда буд, интиқол дода шуд.Гурӯҳи назоратӣ (n = 3 ҳайвон) ҳамон LV-MP-ро бидуни истифодаи магнит гирифтанд.Пас аз анҷоми инфузия, каннула аз найчаи эндотрахеалӣ хориҷ карда мешавад ва ҳайвон экстубатсия карда мешавад.Магнит пеш аз хориҷ шудан 10 дақиқа дар ҷои худ мемонад.Каламушҳо бо мелоксикам (1 мл/кг) (Илиум, Австралия) ба зери пӯст таъин карда шуда, пас аз анестезия бо тазриқи дохили перитонеалӣ атипамазол гидрохлориди 1 мг/кг (Антиседан, Зоетис, Австралия) гирифта шуданд.Каламушҳо то пурра барқарор шудан аз наркоз гарм нигоҳ дошта мешуданд.
Дастгоҳи интиқоли LV-MP дар кабинети бехатарии биологӣ.Шумо мебинед, ки остини хокистарии хокистарии Luer-lock-и найчаи ET аз даҳон мебарояд ва нӯги пипети гел, ки дар расм нишон дода шудааст, тавассути найчаи ET ба чуқурии дилхоҳ ба трахея ворид карда мешавад.
Як ҳафта пас аз тартиби маъмурияти LV-MP, ҳайвонҳо тавассути нафаскашии 100% CO2 ба таври инсонӣ қурбонӣ карда шуданд ва ифодаи LacZ бо истифода аз табобати стандартии X-gal арзёбӣ карда шуд.Се ҳалқаи пайҳомаҳои каудалӣ хориҷ карда шуданд, то боварӣ ҳосил кунанд, ки ягон осеби механикӣ ё нигоҳ доштани моеъ аз ҷойгиркунии найчаи эндотрахеалӣ ба таҳлил дохил карда нашавад.Ҳар як трахея ба дарозии дароз бурида шуд, то ду қисм барои таҳлил ба даст оварда шавад ва дар як коса бо резини силикон (Sylgard, Dow Inc) бо истифода аз сӯзани Minutien (Fine Science Tools) барои дидани сатҳи люминал ҷойгир карда шуд.Тақсим ва хусусияти ҳуҷайраҳои интиқолшуда тавассути аксбардории фронталӣ бо истифода аз микроскопи Nikon (SMZ1500) бо камераи DigiLite ва нармафзори TCapture (Tucsen Photonics, Чин) тасдиқ карда шуд.Тасвирҳо бо калонкунии 20x (аз ҷумла танзими ҳадди аксар барои паҳнои пурраи трахея) гирифта шуданд, ки тамоми дарозии трахея зина ба зина нишон дода шуда, дар байни ҳар як тасвир такрори кофӣ фароҳам меорад, то тасвирҳо "дӯхта" шаванд.Тасвирҳои ҳар як трахея баъдан бо истифода аз версияи Composite Image Editor 2.0.3 (Microsoft Research) бо истифода аз алгоритми ҳаракати ҳамвор ба як тасвири ягона муттаҳид карда шуданд. Майдони ифодаи LacZ дар дохили тасвирҳои таркибии трахея аз ҳар як ҳайвон бо истифода аз скрипти автоматии MATLAB (R2020a, MathWorks) тавре ки қаблан тавсиф шудааст28 бо истифода аз танзимоти 0,35 <Ранг <0,58, Сатрӣ> 0,15 ва Арзиш <0,7 муайян карда шуд. Майдони ифодаи LacZ дар дохили тасвирҳои таркибии трахея аз ҳар як ҳайвон бо истифода аз скрипти автоматии MATLAB (R2020a, MathWorks) тавре ки қаблан тавсиф шудааст28 бо истифода аз танзимоти 0,35 <Hue <0,58, Saturation> 0,15 ва Арзиш <0,7 муайян карда шуд. Площадь экспрессии LacZ дар составных изображениях трахеи аз каждого животного была количественно определена бо истифода аз сенарияи автоматӣ MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, настройка50, 0,15 ва значение <0 ,7. Майдони ифодаи LacZ дар тасвирҳои таркибии трахея аз ҳар як ҳайвон бо истифода аз скрипти автоматии MATLAB (R2020a, MathWorks), тавре ки қаблан тавсиф шудааст28 бо истифода аз танзимоти 0,35 муайян карда шуд.0,15 ва арзиши <0,7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复合图图图国行量化，使用0,35 < 色调< 0,58、饱和度> 0,15 和值< 0,7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 复所 气管 复所表达 量化 ， 使用 使用 使用 0,35 <色调 <0,58 、> 0,15 和值 <0,7 的。。。。 ………………………………………………………………………………HIP Области экспрессии LacZ дар составных изображениях трахеи каждого животного количественно определили сценарии автоматикунонидашудаи MATLAB (R2020a, MathWorks), ҳамчун описано ранее, настроек50, настроек51, значение <0,7 . Майдонҳои ифодаи LacZ дар тасвирҳои таркибии трахеяи ҳар як ҳайвон бо истифода аз скрипти автоматии MATLAB (R2020a, MathWorks), тавре ки қаблан бо истифода аз танзимоти 0,35 < ton < 0,58, сершавӣ > 0,15 ва арзиши < 0,7 тавсиф карда шудаанд, муайян карда шуданд.Тавассути пайгирии контурҳои матоъ дар GIMP v2.10.24, барои ҳар як тасвири таркибӣ ниқоб дастӣ сохта шуд, то минтақаи бофтаро муайян кунад ва аз ҳама гуна ошкоркунии бардурӯғ берун аз бофтаи трахея пешгирӣ кунад.Майдонҳои доғдор аз ҳама тасвирҳои таркибии ҳар як ҳайвон ҷамъ карда шуданд, то майдони умумии оғуштаи ин ҳайвонро диҳад.Минтақаи рангшуда пас аз он ба майдони умумии ниқоб тақсим карда шуд, то майдони муқарраршуда ба даст ояд.
Ҳар як трахея дар парафин ҷойгир карда шуда, ғафсии 5 мкм тақсим карда шуд.Қисмҳо бо ранги сурхи тези бетараф дар тӯли 5 дақиқа муқоиса карда шуданд ва тасвирҳо бо истифода аз микроскопи Nikon Eclipse E400, камераи DS-Fi3 ва нармафзори сабти элементҳои NIS (версияи 5.20.00) гирифта шуданд.
Ҳама таҳлилҳои оморӣ дар GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) анҷом дода шуданд.Аҳамияти оморӣ дар p ≤ 0,05 муқаррар карда шуд.Муътадилӣ бо истифода аз санҷиши Shapiro-Wilk санҷида шуд ва фарқиятҳо дар рангкунии LacZ бо истифода аз t-санҷиш ҷудонашуда арзёбӣ карда шуданд.
Шаш МП, ки дар ҷадвали 1 тавсиф шудаанд, аз ҷониби PCXI тафтиш карда шуданд ва намоёнӣ дар ҷадвали 2 тавсиф шудааст. Ду MP-и полистирол (MP1 ва MP2; мутаносибан 18 мкм ва 0,25 мкм) тавассути PCXI намоён набуданд, аммо намунаҳои боқимондаро муайян кардан мумкин буд. (мисолхо дар расми 5 нишон дода шудаанд).MP3 ва MP4 суст намоёнанд (10-15% Fe3O4; мутаносибан 0,25 мкм ва 0,9 мкм).Гарчанде ки MP5 (98% Fe3O4; 0,25 микрон) дорои баъзе зарраҳои хурдтарини санҷидашуда буд, он аз ҳама равшантар буд.Маҳсулоти CombiMag MP6 фарқ кардан душвор аст.Дар ҳама ҳолатҳо, қобилияти мо барои муайян кардани MFs тавассути ҳаракат додани магнит ба пеш ва бозгашт ба капилляр хеле беҳтар карда шуд.Вақте ки магнитҳо аз капилляр дур шуданд, зарраҳо дар занҷирҳои дароз кашида шуданд, аммо вақте ки магнитҳо наздик шуданд ва қувваи майдони магнитӣ афзоиш ёфт, занҷирҳои зарраҳо кӯтоҳ шуданд, вақте ки зарраҳо ба сатҳи болоии капилляр ҳаракат мекарданд (ниг. Видеои иловагии S1 : MP4), зиёд кардани зичии зарраҳо дар сатҳи.Ва баръакс, вақте ки магнит аз капилляр хориҷ карда мешавад, қувваи майдон коҳиш меёбад ва МПҳо ба занҷирҳои дарозе, ки аз сатҳи болоии капилляр паҳн мешаванд (ниг. Видеои иловагии S2: MP4).Пас аз қатъ шудани ҳаракати магнит, зарраҳо пас аз расидан ба ҳолати мувозинат чанд вақт ҳаракатро идома медиҳанд.Ҳангоме ки МП ба сӯи боло ва дуртар аз сатҳи болоии капилляр ҳаракат мекунад, зарраҳои магнитӣ ба воситаи моеъ хошокро кашида мегиранд.
Намоиши MP дар PCXI дар байни намунаҳо ба таври назаррас фарқ мекунад.(а) MP3, (б) MP4, (в) MP5 ва (г) MP6.Ҳама тасвирҳои дар ин ҷо нишондодашуда бо магните гирифта шудаанд, ки бевосита дар болои капилляр тақрибан 10 мм ҷойгир шудаанд.Доираҳои калони намоён футурҳои ҳавоӣ мебошанд, ки дар капиллярҳо ҷойгир шудаанд, ки хусусиятҳои канори сиёҳ ва сафеди тасвири контрасти фазаро равшан нишон медиҳанд.Қуттии сурх андозаи афзоишро нишон медиҳад, ки контрастро беҳтар мекунад.Дар хотир доред, ки диаметрҳои схемаҳои магнитӣ дар ҳама рақамҳо ба миқёс нестанд ва тақрибан 100 маротиба калонтар аз нишон дода шудаанд.
Вақте ки магнит дар болои капилляр ба чап ва рост ҳаракат мекунад, кунҷи сатри МП тағир меёбад, ки бо магнит мувофиқат мекунад (ниг. расми 6) ва ҳамин тавр хатҳои майдони магнитиро муайян мекунанд.Барои MP3-5 пас аз расидани аккорд ба кунҷи остона зарраҳо дар сатҳи болоии капилляр кашола мешаванд.Ин аксар вақт ба он оварда мерасонад, ки депутатҳо ба гурӯҳҳои калонтар дар наздикии он ҷое, ки майдони магнитӣ қавитарин аст, ҷамъ мешаванд (нигаред ба Видеои иловагӣ S3: MP5).Ин инчунин ҳангоми тасвир дар наздикии охири капилляр, ки боиси ҷамъшавии МП дар интерфейси моеъ ва ҳаво мегардад, равшан аст.Зарраҳои MP6, ки нисбат ба зарраҳои MP3-5 фарқ кардан душвортар буданд, ҳангоми ҳаракати магнит дар канори капилляр кашола нашуданд, аммо сатрҳои МП аз ҳам ҷудо шуданд ва зарраҳоро дар назар нигоҳ медоштанд (ниг. Видеои иловагии S4: MP6).Дар баъзе мавридҳо, вақте ки майдони магнитии истифодашаванда бо интиқол додани магнит ба масофаи дур аз макони тасвир кам карда шуд, ҳама гуна депутатҳои боқимонда бо ҷозиба оҳиста ба сатҳи поёни найча фуромада, дар сатр мемонданд (ниг. Видеои иловагии S5: MP3) .
Кунҷи сатри МП ҳангоми ҳаракат кардани магнит ба тарафи рост аз капилляр тағйир меёбад.(а) MP3, (б) MP4, (в) MP5 ва (г) MP6.Қуттии сурх андозаи афзоишро нишон медиҳад, ки контрастро беҳтар мекунад.Лутфан таваҷҷӯҳ намоед, ки видеоҳои иловагӣ барои мақсадҳои иттилоотӣ мебошанд, зеро онҳо сохтори муҳими зарраҳо ва иттилооти динамикиро ошкор мекунанд, ки онҳоро дар ин тасвирҳои статикӣ дидан мумкин нест.
Санҷишҳои мо нишон доданд, ки оҳиста-оҳиста ба пасу пеш ҳаракат кардани магнит дар қад-қади трахея визуализатсияи MF-ро дар заминаи ҳаракати мураккаб дар vivo осон мекунад.Санҷишҳои in vivo гузаронида нашуданд, зеро маҳтобҳои полистирол (MP1 ва MP2) дар капилляр намоён набуданд.Ҳар яке аз чор MF-и боқимонда дар vivo бо меҳвари дарози магнит дар болои трахея дар кунҷи тақрибан 30 ° ба амудӣ ҷойгир карда шуд (ниг. Расмҳои 2b ва 3a), зеро ин занҷирҳои МФ дарозтар шуд ва самараноктар буд. аз магнит..конфигуратсия қатъ карда шуд.MP3, MP4 ва MP6 дар трахеяи ягон ҳайвони зинда ёфт нашудааст.Ҳангоми дидани роҳи нафаскашии каламушҳо пас аз куштани ҳайвонот, зарраҳо ҳатто ҳангоми илова кардани ҳаҷми иловагӣ бо насоси сӯзандоруҳо ноаён мемонданд.MP5 дорои баландтарин миқдори оксиди оҳан буд ва ягона заррачаи намоён буд, аз ин рӯ он барои арзёбӣ ва тавсифи рафтори MP дар vivo истифода мешуд.
Ҷойгиркунии магнит дар болои трахея ҳангоми ворид кардани MF боиси он гардид, ки бисёриҳо, аммо на ҳама, MF-ҳо дар майдони назар мутамарказ шуданд.Дохилшавии зарраҳо ба трахея беҳтар дар ҳайвоноти аз ҷониби инсон эвтанизатсияшуда мушоҳида карда мешавад.Тасвири 7 ва Видеои иловагии S6: MP5 аксбардории босуръати магнитӣ ва ҳамоҳангсозии зарраҳоро дар сатҳи трахеяи вентралӣ нишон медиҳад, ки нишон медиҳад, ки депутатҳо метавонанд ба минтақаҳои дилхоҳи трахея равона карда шаванд.Ҳангоми ҷустуҷӯи дуртар аз трахея пас аз интиқоли МФ, баъзе MF-ҳо ба карина наздиктар пайдо шуданд, ки ин нишон медиҳад, ки қувваи нокифояи майдони магнитӣ барои ҷамъоварӣ ва нигоҳ доштани ҳама MFs, зеро онҳо тавассути минтақаи ҳадди қувваи майдони магнитӣ ҳангоми истифодаи моеъ интиқол дода шудаанд.раванд.Бо вуҷуди ин, консентратсияи МП пас аз таваллуд дар атрофи минтақаи тасвир баландтар буд ва аз он шаҳодат медиҳад, ки бисёре аз депутатҳо дар минтақаҳои роҳи ҳавоӣ боқӣ мемонанд, ки дар он ҷо қувваи майдони магнитии истифодашуда баландтар буд.
Тасвирҳои (а) пеш аз ва (б) пас аз интиқоли MP5 ба трахеяи каламуши ба наздикӣ эвтанизатсияшуда бо магните, ки дар болои майдони тасвир ҷойгир шудааст.Майдони тасвиршуда дар байни ду ҳалқаи пайҳона ҷойгир аст.Пеш аз интиқоли МП дар роҳҳои нафас каме моеъ мавҷуд аст.Қуттии сурх андозаи афзоишро нишон медиҳад, ки контрастро беҳтар мекунад.Ин тасвирҳо аз видеои дар S6 пешниҳодшуда гирифта шудаанд: Видеои иловагии MP5.
Ҳаракати магнит дар баробари трахея дар vivo боиси тағирёбии кунҷи занҷири МП дар сатҳи роҳи нафас гардид, ки ба он чизе ки дар капиллярҳо мушоҳида мешавад (ниг. Расми 8 ва Видеои иловагии S7: MP5).Бо вуҷуди ин, дар таҳқиқоти мо, депутатҳоро дар сатҳи роҳҳои нафаскашии зинда кашола карда наметавонистанд, чунон ки капиллярҳо карда метавонанд.Дар баъзе мавридҳо занҷири МП ҳангоми ҳаракати магнит ба чап ва рост дароз мешавад.Ҷолиб он аст, ки мо инчунин дарёфтем, ки занҷири зарраҳо ҳангоми ҳаракати магнит дар баробари трахея умқи қабати рӯизаминии моеъро тағир медиҳад ва вақте ки магнит мустақиман аз болои трахея ҳаракат мекунад ва занҷири заррачаҳо ба ҳолати амудӣ гардиш мекунанд, васеъ мешавад (ниг. Видеои иловагӣ S7).: MP5 дар 0:09, дар поёни рост).Намунаи харакати характернок хангоме ки магнит ба пахлуи болои трахея (яъне ба тарафи чап ё рости хайвон, на дар дарозии трахея) гузаронида шуд, тагйир ёфт.Зарраҳо дар давоми ҳаракати онҳо ба таври равшан намоён буданд, аммо вақте ки магнит аз трахея хориҷ карда шуд, нӯги сатрҳои зарраҳо намоён шуданд (нигаред ба Видеои иловагӣ S8: MP5, оғоз аз 0:08).Ин ба рафтори мушоҳидашудаи майдони магнитӣ дар зери таъсири майдони магнитии татбиқшаванда дар капиллярҳои шишагӣ мувофиқ аст.
Тасвирҳои намунавӣ, ки MP5-ро дар трахеяи каламуши зинда наркозшуда нишон медиҳанд.$A) Магнит барои ба даст овардани тасвирҳо дар боло ва чапи трахея истифода мешавад, сипас (б) пас аз ҳаракат кардани магнит ба тарафи рост.Қуттии сурх андозаи афзоишро нишон медиҳад, ки контрастро беҳтар мекунад.Ин тасвирҳо аз видеое мебошанд, ки дар Видеои иловагии S7 нишон дода шудаанд: MP5.
Вақте ки ду қутбҳо дар самти шимолу ҷануб аз боло ва поёни трахея танзим карда шуданд (яъне ҷалбкунанда; Расми 3б), аккордҳои МП дарозтар пайдо шуданд ва на дар сатҳи дорсалии трахея дар девори паҳлуи трахея ҷойгир шуданд. трахея (ниг. ба замима).Видео S9: MP5).Бо вуҷуди ин, консентратсияи баланди зарраҳо дар як макон (яъне, сатҳи дорсалии трахея) пас аз ворид кардани моеъ бо истифода аз дастгоҳи магнитии дугона, ки одатан бо як дастгоҳи магнитӣ рух медиҳад, ошкор карда нашуд.Пас, ваќте ки як магнит барои бозгардонидани ќутбњои муќобил конфигуратсия карда шуд (расми 3в), шумораи заррањое, ки дар майдони назар намоён буданд, пас аз расонидани он зиёд нашуд.Танзими ҳарду конфигуратсияи магнитӣ аз сабаби қувваи баланди майдони магнитӣ, ки мутаносибан магнитҳоро ҷалб ё тела медиҳад, душвор аст.Пас аз он насб ба як магнити ягонаи параллел ба роҳҳои ҳавоӣ иваз карда шуд, аммо аз роҳи нафас бо кунҷи 90 дараҷа мегузаранд, то хати қувва аз девори трахея ба таври ортогоналӣ убур кунад (Расми 3d), самте барои муайян кардани имкони ҷамъшавии зарраҳо дар девори паҳлуӣ.риоя карда шавад.Аммо, дар ин конфигуратсия, ҳаракати муайяншавандаи ҷамъшавии MF ё ҳаракати магнит вуҷуд надошт.Дар асоси ҳамаи ин натиҷаҳо, конфигуратсия бо як магнити ягона ва самти 30-дараҷа барои омӯзиши in vivo интиқолдиҳандагони ген интихоб карда шуд (расми 3а).
Вақте ки ҳайвон дарҳол пас аз қурбонии инсонӣ чанд маротиба тасвир карда шуд, мавҷуд набудани ҳаракати халалдоркунандаи бофта маънои онро дошт, ки хатҳои хурдтар ва кӯтоҳтари зарраҳоро дар майдони равшани байнииғҳорӣ, ки мувофиқи ҳаракати тарҷумаи магнит "ҷунбонда" мешаванд, дидан мумкин аст.мавҷудият ва ҳаракати зарраҳои MP6-ро равшан бубинед.
Титри LV-LacZ 1,8 x 108 IU / мл буд ва пас аз омехта кардани 1: 1 бо CombiMag MP (MP6), ба ҳайвонҳо бо 50 мкл вояи трахеяи 9 x 107 IU / мл автомобили LV (яъне 4,5) сӯзандору карда шуданд. x 106 TU/ каламуш).).).Дар ин таҳқиқот, ба ҷои ҳаракат додани магнит ҳангоми меҳнат, мо магнитро дар як мавқеъ муқаррар кардем, то муайян кунем, ки оё интиқоли LV метавонад (a) нисбат ба интиқоли вектор дар сурати мавҷуд набудани майдони магнитӣ беҳтар карда шавад ва (б) агар роҳи нафас метавонад равона карда шавад.Ҳуҷайраҳо дар минтақаҳои ҳадафи магнитии роҳҳои болоии нафаскашӣ интиқол дода мешаванд.
Мавҷудияти магнитҳо ва истифодаи CombiMag дар якҷоягӣ бо векторҳои LV ба саломатии ҳайвонҳо таъсири манфӣ нарасонданд, ба монанди протоколи стандартии интиқоли вектори LV.Тасвирҳои фронталии минтақаи трахея, ки ба халалдоршавии механикӣ дучор шудаанд (расми 1) нишон доданд, ки гурӯҳи коркардшудаи LV-MP дар ҳузури магнит сатҳи баланди трансдуксияро дошт (расми 9а).Дар гурӯҳи назоратӣ танҳо миқдори ками ранги кабуди LacZ мавҷуд буд (Тасвири 9б).Миқдори минтақаҳои нормалшудаи X-Gal доғдор нишон дод, ки маъмурияти LV-MP дар ҳузури майдони магнитӣ тақрибан 6 маротиба беҳтар шуд (расми 9c).
Намунаи тасвирҳои таркибӣ, ки интиқоли трахеяро ​​бо LV-MP (а) дар ҳузури майдони магнитӣ ва (б) дар набудани магнит нишон медиҳанд.(в) Беҳтаршавии аз ҷиҳати оморӣ муҳим дар минтақаи нормалшудаи интиқоли LacZ дар трахея бо истифодаи магнит (*p = 0,029, t-санҷиш, n = 3 барои як гурӯҳ, миёна ± хатои стандартии миёна).
Қисмҳои рангаи сурхи зуд бетараф (мисол дар расми иловагӣ нишон дода шудааст. 2) нишон доданд, ки ҳуҷайраҳои рангкардаи LacZ дар ҳамон намуна ва дар ҳамон маконе мавҷуданд, ки қаблан хабар дода шуда буд.
Мушкилоти калидӣ дар терапияи гении роҳи нафас ин локализатсияи дақиқи зарраҳои интиқолдиҳанда дар минтақаҳои мавриди таваҷҷӯҳ ва ноил шудан ба сатҳи баланди самаранокии интиқол дар шуши мобилӣ дар ҳузури ҷараёни ҳаво ва тозакунии фаъоли луоб боқӣ мемонад.Барои интиқолдиҳандагони LV, ки барои табобати бемориҳои узвҳои нафас дар фибрози кистикӣ пешбинӣ шудаанд, зиёд кардани вақти будубоши зарраҳои интиқолдиҳанда дар роҳҳои ҳавои гузаронанда то ҳол ҳадафи дастнорас буд.Тавре ки Кастеллани ва дигарон қайд карданд, истифодаи майдонҳои магнитӣ барои баланд бардоштани интиқол нисбат ба дигар усулҳои интиқоли генҳо бартарият дорад, ба монанди электропоратсия, зеро он метавонад содда, сарфакорӣ, интиқоли маҳаллӣ, баланд бардоштани самаранокӣ ва вақти кӯтоҳтари инкубатсияро муттаҳид кунад.ва эҳтимолан вояи камтари воситаҳои нақлиёт10.Бо вуҷуди ин, дар in vivo ҷойгиршавӣ ва рафтори зарраҳои магнитӣ дар роҳҳои нафас дар зери таъсири қувваҳои магнитии беруна ҳеҷ гоҳ тавсиф карда нашудааст ва дар асл қобилияти ин усул барои баланд бардоштани сатҳи ифодаи генҳо дар роҳҳои нафасии зинда дар vivo нишон дода нашудааст.
Таҷрибаҳои in vitro мо дар синхротрони PCXI нишон доданд, ки ҳама зарраҳои мо озмоиш кардем, ба истиснои полистироли MP, дар танзимоти тасвирие, ки мо истифода мебурдем, намоён буданд.Дар мављудияти майдони магнитї майдонњои магнитї сатрњоеро ташкил медињанд, ки дарозии онњо ба навъи заррањо ва ќувваи майдони магнитї (яъне ба наздикї ва њаракати магнит) вобаста аст.Тавре ки дар расми 10 нишон дода шудааст, сатрҳое, ки мо мушоҳида мекунем, вақте ба вуҷуд меоянд, ки ҳар як заррачаи алоҳида магнитӣ мешавад ва майдони магнитии маҳаллии худро ба вуҷуд меорад.Ин майдонҳои ҷудогона боиси ҷамъ шудани дигар заррачаҳои ба ҳам монанд мешаванд ва бо ҳаракатҳои сатри гурӯҳӣ аз ҳисоби қувваҳои маҳаллӣ аз қувваҳои маҳаллии ҷалб ва бозгардонидани зарраҳои дигар ҷамъ мешаванд.
Диаграмма нишон медиҳад (а, б) занҷирҳои заррачаҳо, ки дар дохили капиллярҳои пур аз моеъ ва (в, г) трахеяи пур аз ҳаво ташкил мешаванд.Дар хотир доред, ки капиллярҳо ва трахея ба миқёс ҷалб карда намешаванд.Панели (а) инчунин тавсифи MF-ро дар бар мегирад, ки заррачаҳои Fe3O4 дар занҷир ҷойгир шудаанд.
Вақте ки магнит аз болои капилляр ҳаракат кард, кунҷи сатри зарраҳо барои MP3-5, ки Fe3O4 дорад, ба ҳадди критикӣ расид, ки баъд аз он тори зарраҳо дигар дар ҳолати аввалааш намемонд, балки дар баробари сатҳ ба мавқеъи нав ҳаракат мекард.магнит.Эҳтимол ин таъсир аз он сабаб ба амал меояд, ки сатҳи капилляри шиша ба қадри кофӣ ҳамвор аст, то ин ҳаракатро ба амал орад.Ҷолиб он аст, ки MP6 (CombiMag) ин тавр рафтор накард, шояд аз он сабаб, ки зарраҳо хурдтар буданд, пӯшиш ё заряди сатҳи дигар доштанд ё моеъи интиқолдиҳандаи хусусӣ ба қобилияти ҳаракати онҳо таъсир расонд.Баръакси тасвири заррачаҳои CombiMag низ заифтар аст ва аз он шаҳодат медиҳад, ки моеъ ва зарраҳо метавонанд зичии якхела дошта бошанд ва аз ин рӯ наметавонанд ба осонӣ ба сӯи ҳамдигар ҳаракат кунанд.Зарраҳо инчунин метавонанд часпида шаванд, агар магнит аз ҳад зиёд ҳаракат кунад ва ин нишон медиҳад, ки қувваи майдони магнитӣ наметавонад ҳамеша соиши байни зарраҳои моеъро бартараф кунад ва аз он шаҳодат медиҳад, ки қувваи майдони магнитӣ ва масофаи байни магнит ва минтақаи мавриди ҳадаф набояд ҳамчун як зарбаи сахт ба вуҷуд ояд. ҳайрон.муҳим.Ин натиҷаҳо инчунин нишон медиҳанд, ки ҳарчанд магнитҳо метавонанд микрозарчаҳои зиёдеро, ки аз минтақаи мавриди ҳадаф ҷорӣ мешаванд, сабт кунанд, аз эҳтимол дур нест, ки магнитҳо барои ҳаракат додани зарраҳои CombiMag дар сатҳи трахея такя кунанд.Ҳамин тариқ, мо ба хулосае омадем, ки таҳқиқоти LV MF дар vivo бояд майдонҳои магнитии статикиро барои ҳадафи ҷисмонӣ ба минтақаҳои мушаххаси дарахти роҳи нафас истифода баранд.
Пас аз он ки зарраҳо ба бадан ворид карда мешаванд, онҳоро дар заминаи бофтаи мураккаби ҳаракаткунандаи бадан муайян кардан душвор аст, аммо қобилияти муайянкунии онҳо тавассути ҳаракат кардани магнит ба таври уфуқӣ дар болои трахея барои “чағ задани” сатрҳои МП беҳтар шудааст.Гарчанде ки тасвири воқеӣ дар вақти воқеӣ имконпазир аст, пас аз кушта шудани ҳайвон ҳаракати зарраҳо осонтар аст.Консентратсияи МП одатан дар ин макон баландтар буд, вақте ки магнит дар болои минтақаи тасвир ҷойгир буд, гарчанде ки баъзе зарраҳо одатан дар поёнтар аз трахея пайдо мешуданд.Баръакси таҳқиқоти in vitro, зарраҳоро тавассути ҳаракати магнит ба трахея кашидан мумкин нест.Ин бозёфт ба он мувофиқ аст, ки чӣ гуна луобе, ки сатҳи трахеяро ​​мепӯшонад, маъмулан зарраҳои нафаскашидаро коркард карда, онҳоро дар луоб нигоҳ медорад ва баъдан онҳоро тавассути механизми тозакунии луобпарда тоза мекунад.
Мо фарзия кардем, ки истифодаи магнитҳои боло ва поёни трахея барои ҷалб кардан (расми 3б) метавонад ба майдони магнитии якхела оварда расонад, на майдони магнитӣ, ки дар як нуқта хеле мутамарказ аст ва эҳтимолан ба тақсимоти якхелаи зарраҳо оварда мерасонад..Бо вуҷуди ин, таҳқиқоти пешакии мо барои тасдиқи ин фарзия далелҳои равшане пайдо накард.Ба ҳамин монанд, гузоштани як ҷуфт магнит барои бозгардонидан (расми 3в) боиси ҷойгиршавии бештари зарраҳо дар минтақаи тасвир нашуд.Ин ду бозёфт нишон медиҳанд, ки танзими дугонаи магнитӣ назорати маҳаллии ишораи МП-ро ба таври назаррас беҳтар намекунад ва дар натиҷа қувваҳои магнитии қавӣ танзим кардан душвор аст ва ин равишро камтар амалӣ мекунад.Ба ҳамин монанд, ориентация кардани магнит аз болои трахея (Расми 3d) инчунин шумораи зарраҳои дар минтақаи тасвиршуда боқӣ мондаро зиёд накард.Баъзе аз ин конфигуратсияҳои алтернативӣ метавонанд муваффақ набошанд, зеро онҳо ба паст шудани қувваи майдони магнитӣ дар минтақаи таҳшин оварда мерасонанд.Ҳамин тариқ, конфигуратсияи ягонаи магнитӣ дар 30 дараҷа (расми 3а) соддатарин ва самараноктарин усули санҷиш дар vivo ҳисобида мешавад.
Тадқиқоти LV-MP нишон дод, ки вақте векторҳои LV бо CombiMag якҷоя карда шуданд ва пас аз осеби ҷисмонӣ дар ҳузури майдони магнитӣ интиқол дода шуданд, сатҳи интиқол дар трахея нисбат ба назорат ба таври назаррас афзоиш ёфт.Дар асоси таҳқиқоти синхротронӣ ва натиҷаҳои LacZ, майдони магнитӣ қодир буд, ки LV-ро дар трахея нигоҳ дорад ва шумораи зарраҳои векториро, ки фавран ба шуш чуқур дохил мешаванд, кам кунад.Чунин такмилдиҳии мақсаднок метавонад ба самаранокии баландтар ҳангоми кам кардани титрҳои расонидашуда, интиқоли ғайримақсаднок, таъсири манфии илтиҳобӣ ва иммунӣ ва хароҷоти интиқоли генҳо оварда расонад.Муҳим он аст, ки ба гуфтаи истеҳсолкунанда, CombiMag метавонад дар якҷоягӣ бо дигар усулҳои интиқоли генҳо, аз ҷумла дигар векторҳои вирусӣ (ба монанди AAV) ва кислотаҳои нуклеинӣ истифода шавад.